Tema:
Bacteriología de la Tuberculosis.
Autor:
Prof. Agdo. Dr. Carlos Ma. Rivas Chetto.
Después de 20 años de disminución
sostenida de la Tuberculosis (TB) en el Uruguay, se observa -desde 1993- una estabilización (1) con una
tendencia al ascenso a partir del 2000
(tabla 1). Esta reemergencia de la enfermedad se observa también a nivel
mundial, lo cual genera una declaración de Epidemia, por la Organización
Mundial de la Salud (2). Entre los factores generadores se destacan el aumento
sustantivo de la pobreza, la coinfección con el virus de la inmunodeficiencia
adquirida (VIH), la falta de atención a los Programas de Lucha Antituberculosa,
la aparición de cepas resistentes y multirresistentes y algunos reservorios
difíciles de controlar como las prisiones (3).
Como en ninguna otra enfermedad , el
laboratorio tiene una capital importancia; no se exagera cuando se afirma que
el laboratorio bacteriológico es la piedra angular de toda la lucha
antituberculosa.
Describiremos los distintos tipos de
estudios y su valor, que en la actualidad están disponibles para la
confirmación de la TB. Si bien en los últimos años se están desarrollando
técnicas muy atractivas en torno al estudio de ácidos nucleicos la
bacteriología convencional continúa
siendo insustituíble aún en los mejores centros de diagnóstico bacteriológico (4).
La Bacteriología convencional
Consta
de dos grandes áreas: La microscopía
y los cultivos.
Microscopía.
Tanto en un laboratorio periférico como en un
Centro de Referencia, la primera etapa del diagnóstico bacteriológico es el
estudio microscópico a partir de un extendido realizado con la muestra enviada.
Para el caso de los esputos el estudio microscópico (D) tiene varios sinónimos:
“baciloscopía”, “estudio directo”, “directo”,
todos de igual significado:
poner en evidencia las mycobacterias mediante
tinciones específicas. Las técnicas de coloración se han mantenido sin
modificaciones en el tiempo; las mycobacterias poseen casi exclusivamente la
propiedad de resistir soluciones decolorantes enérgicas (alcohol-ácido) llamada
ácido alcohol resistencia y de ahí el nombre de bacilos ácido alcohol
resistentes (baar). Esencialmente se puede utilizar el método de Ziehl-Neelsen
(ZN) -con fucsina fenicada en caliente-
la de Kinyoun -fucsina fenicada en frío-, realizando la observación
microscópica durante 20 minutos a 800 o 1000 aumentos. Otros métodos utilizan
colorantes fluorescentes (F) (auramina o auramina/rodamina) realizando la
observación en microscopios de fluorescencia a 200 – 400 aumentos. Las
mycobacterias se observan claramente como bacilos rojos sobre fondo azul (ZN) o
en amarillo flúo (F) sobre fondo oscuro según el método usado El extendido
puede hacerse, teñirse y leerse en un tiempo total de 2 horas, en consecuencia
ningún Servicio debería esperar más de
24 horas para conocer el resultado de un D. Las principales ventajes del directo
son: la rapidez, la simpleza y el bajo costo para la obtención de resultados, resaltemos que en muestras
de esputos la presencia de baar es, en la práctica, diagnóstica de TB y permite
activar todos los mecanismos sanitarios a nivel individual y epidemiológico.
Las desventajas de la microscopía radican en: a) la baja sensibilidad -inherente al procedimiento- que puede
llegar a un 50 % menor que los cultivos. Para poder observar 1 bacilo al microscópico
es necesaria una concentración
aproximada de 10.000 gérmenes por al de muestra; por tanto el
rendimiento del D en muestras de bajo contenido de bacilos -LCR, líquidos
pleurales, esputos de pacientes paucibacilares- es muy bajo; b) no
es posible identificar la especie de
mycobacteria ni estudiar su resistencia a los fármacos, pasos imprescindibles en algunas situaciones.
En nuestro País la TB pulmonar se confirma
por el D en un 70 a 75 % de los casos (tabla 1, gráfica 1).
Otras ventajas de la microscopía
Utilizando un recuento semicuantitativo
es posible establecer el número de bacilos que el enfermo está eliminando. Con
límites entre el Negativo y el Positivo tres cruces (+++) se pueden tener, dentro de ciertos límites, importantes
pautas de diagnóstico y seguimiento. El número de bacilos eliminados
cuantificados en cruces permite:
a)
tener una idea de la severidad, la extensión de las lesiones y el tiempo de evolución de la TB; b) tener idea sobre la peligrosidad del
caso en relación al contagio a sus contactos; c) poder controlar la evolución
de la enfermedad y la eficacia del tratamiento instituído; d) realizar
pesquisas bacteriológicas para detectar rápidamente otros enfermos
contagiantes.
Cultivos.
Los cultivos convencionales (CC) en medios
sólidos a base de huevo tales como el Lowenstein Jensen o medios sintéticos
líquidos o sólidos (Middlebrook 7H9 - 7 H11) resultan apropiados para el
desarrollo de casi todas las especies de mycobacterias. Su importancia radica
en:
a) Poseen mayor sensibilidad que el D
confirmando la enfermedad en un porcentaje de enfermos negativos al D (aprox.
15 % de los casos de TB pulmonar en Uruguay).
b) Permiten el aislamiento de cepas
bacterianas, punto de inicio para la identificación de especies, realización de
pruebas de sensibilidad a fármacos antituberculosos y técnicas en ácidos nucleicos.
c) Son imprescindibles para confirmar casos de TB
extrapulmonares y diferenciar patologías provocadas por mycobacterias no TB
(MNT).
Sin embargo no están exentos de desventajas, a saber:
a) La demora en obtener desarrollo apreciable de colonias (3 a 6
semanas) propia de varias especies patógenas del género.
b) La complejidad y el costo lo cual hace que laboratorios de baja
o mediana capacidad no estén en
condiciones de sustentar una técnica de
este tipo.
c) Las medidas de
Bioseguridad necesarias para controlar contaminación del personal.
Adicionalmente es posible afirmar que si los
cultivos no se realizan adecuadamente los resultados son similares a los
directos.
La necesidad de obtener resultados
precozmente ha motivado el desarrollo de Sistemas de detección de desarrollo
más rápidos, conocidos como cultivos rápidos (CR). El primer sistema surgió
hace unos 20 años y aun persiste en el
mercado. Se trata de un sistema radiométrico identificado como BACTEC 460
TB. El sistema detecta la cantidad de
CO2 radioactivo que se genera
dentro del frasco de cultivo cuando las mycobacterias consumen nutrientes de
carbono (ácido palmítico) con sustitución del C con su isótopo: el C14. El producto final del metabolismo bacteriano será el 14CO2. El incremento en los niveles de este gas
puede ser medido por un contador de isótopos y
determinar si un cultivo es positivo. Este sistema está definitivamente
probado y se le considera de referencia
como otros medios convencionales. Posee
las siguientes ventajas:
a)
Resultados
rápidos: 11 días para muestras positivas al D.
14 días para muestras
negativas al D.
b)
Posibilidad de realizar pruebas de sensibilidad a fármacos antituberculosos.
c)
Excelente recuperación de mycobacterias.
Sus principales desventajas son:
a)
Costos.
b)
Necesidad
de infraestructura adecuada para el manejo de radioisótopos.
c)
Mayores
porcentajes de contaminación por lecturas manuales.
d)
Método
no totalmente automatizado, requiere
muchas horas/técnico.
En orden de superar estas importantes
limitaciones se introdujeron al mercado, nuevos CR de tipo colorimétrico. En la
actualidad se dispone de tres opciones: el Sistema MB-BacT, el sistema MGIT y
el ESP II. Muy similares entre si, básicamente estos sistemas superan al BACTEC
460 TB en:
a)
Son
sistemas no radiactivos, totalmente automatizados.
b)
Exigen
menor mano de obra
c)
La
contaminación intra laboratorio es menor
d)
Poseen
una aceptable equivalencia en resultados, para todas las posibilidades.
Los CR
positivos se detectan algo mas lentamente (promedio 4 días) que el
método radiactivo. En Uruguay se adoptó el MB-BacT; se trata de un sistema reflectométrico computarizado que
esencialmente funciona de la siguiente manera:
a)
El
sistema detecta los niveles CO2 existentes en el frasco de cultivo. Si existe desarrollo de
mycobacterias se genera CO2 como producto final del metabolismo oxidativo.
b)
En
el fondo del frasco se ubica una membrana (sensor) que cambia de color según el
tenor de CO2..
c)
Un
haz de luz incide sobre la membrana y
se refleja con diferente longitud de onda según el color de la misma.
d)
El
haz reflejado es registrado por un aparato lector cada 10 minutos y analizado
por el ordenador.
e)
Una
vez que las lecturas sobrepasan una línea basal preestablecida se activa una
alarma sonora que indica cultivo positivo.
f)
De
no producirse esta situación el equipo mantiene la incubación y lecturas
durante 42 días para descartarlo entonces como “Negativo”.
En adición a la practicidad y la rapidez,
este sistema puede utilizarse para pruebas de identificación complementarias y
pruebas sensibilidad a los fármacos antituberculosos más importantes. Se debe
enfatizar que las ventajas que aportan los
CR a un laboratorio deben ser acompañadas de otras técnicas que
mantengan y amplíen la rapidez de los resultados sobre los métodos
convencionales. Comenzar un estudio con CR para después continuar con la
bacteriología tradicional significa terminar la tarea tan tarde como si el
laboratorio utilizara solamente métodos
convencionales.
Identificación bacteriana.
La identificación fenotípica de las mycobacterias por características
de desarrollo y pruebas bioquímicas es muy lenta (2 meses de promedio),
demorando la identificación bacteriana demasiado, aun para tareas de monitoreo.
Es posible realizar métodos screening que permitan diferenciar el complejo M. tuberculosis (MTB) del resto de la
mycobacterias
MNT;
los estudios de desarrollo en presencia de agente inhibitorios selectivos es de
gran ayuda y puede realizarse en los sistemas de CR Así por ejemplo el complejo MTB
es inhibido por el agregado al medio de cultivo de sustancias como el
PNB (ácido para amino benzoico) o la NAP (para-nitro-α-acetylamino-β-hidroxipropiophenona),
mientras que el resto de las MNT no lo son; asimismo la TCH (hidracida del ácido
tio-pheno-carboxílico) inhibe selectivamente a M. Bovis/bcg dentro del complejo MTB. En muchos casos se trata de
procedimientos insuficientes ya que no es posible avanzar en la identificación
de los MNT patógenos oportunistas más frecuentes como M. avium, M .kansasii y otros.
La cromatografía líquida de alta
presión (HPLC) permite realizar la identificación de las mycobacterias en
función de la constitución lipídica de la pared bacteriana. Extremadamente cara
y de alta complejidad solamente es utilizada por laboratorios de alta
investigación.
Puebas de sensibilidad.
Las pruebas de sensibilidad a
los fármacos antituberculosos son imprescindibles y recomendadas para la
vigilancia epidemiológica de la resistencia. Malos tratamientos o mala
supervisión de los mismos generan cepas resistentes; grupos de alto riesgo
difíciles de manejar y controlar (reclusos, SIDA) también. La sensibilidad a
los fármacos esenciales se investiga en todo enfermo nuevo, en fracasos de
tratamiento y en recaídas. Los tests se realizan sobre medios de cultivo convencionales y sobre
sistemas de CR. En todos se pueden obtener excelentes resultados si se mantienen
estrictamente las normas de control de calidad. La demora hace poco útil este tipo de estudios con carácter
asistencial ya que los resultados se
obtienen en 6 semanas por métodos convencionales y en 12 días por los sistemas
de CR; en consecuencia el Neumólogo siempre recibe una imagen vieja de la
situación.
La biología molecular o técnicas en ácidos
nucleicos (TAN).
El desbordante desarrollo de esta área de la biología alcanzó también a las mycobacterias; la
necesidad de respuestas rápidas al diagnóstico, la identificación, la
sensibilidad y las aplicaciones epidemiológicas han desarrollado TAN para todas
las situaciones. Es necesario discriminar y analizar por separado las
diferentes áreas de acción de la TAN. Tres, son los sectores que podemos establecer
claramente: el diagnóstico de la TB, la identificación y la sensibilidad a los
fármacos y la investigación epidemiológica.
TAN aplicadas al diagnóstico de la TB.
Las primeras TAN aplicadas a la TB
surgieron originalmente como screening
para la pesquisa indiscriminada de la
TB pulmonar, y tuvieron resultados muy modestos. No analizaremos aquí técnicas
“in house” ya que en cada país los investigadores ponen a punto técnicas con
“excelentes resultados” los cuales no son
confirmados luego en grandes y bien diseñados protocolos. Existen
dos técnicas comerciales en uso y parcialmente aprobadas el MTD (de Gen Probe) y el Amplicor (de Roche). En
los ensayos iniciales realizados con poblaciones de baja prevalencia, la
sensibilidad(S) y especificidad (Sp) alcanzadas eran bajas (aprox. 50 %), no
sucedía lo mismo cuando las muestras eran positivas al D. La S
y la Sp alcanzaban un 95% cuando
la muestra era positiva al D (5). En 1998 Gen Probe perfecciona su sistema MTD (ahora llamado MTD2) y lo
lanza al mercado orientado al diagnóstico en enfermos con sospecha clínica de
TB y para muestras de esputos. Los resultados observados fueron realmente importantes y se documentan en ensayos controlados (6,7)
y no controlados. De ahora en más es posible contar con una TAN para
diagnóstico de la TB pulmonar que proporciona resultados confiables sencilla y rápidamente. Es muy importante resaltar
que ni los mismos fabricantes recomiendan el producto para ser ensayado en
otras muestras que no sean esputos, ya que diferentes factores distorsionan los
resultados. Teniendo en cuenta el rendimiento del MTD2 y sus costos,
deben establecerse protocolos de uso
para que el diagnóstico resulte en el
mayor beneficio para el paciente y para el sistema sanitario. Es imprescindible elaborar guías de
aplicación para hacer un uso racional
de métodos costosos. Las TAN no deben reemplazar los métodos convencionales
para el manejo bacteriológico de la TB, sino que deben emplearse en forma
complementaria. Cuando el paciente tiene una enfermedad por MNT la relación
costo beneficio es excelente; además en casos de D positivos en muestras únicas
o de validez dudosa una técnica
complementaria concordante o discordante
define la situación.
TAN aplicadas a la identificación bacteriana.
Hemos dicho que la identificación fenotípica es lenta y a menudo insuficiente en las mycobacterias. Si bien
en la mayoría de los casos una identificación parcial es útil para nuestro País
–en donde el 98% de los aislamientos clínicos corresponde a M. tuberculosis- existen situaciones
donde es necesario obtener una
identificación precisa rápidamente. La identificación genotípica es posible
para las especies o complejos patógenos más frecuentes. Existen algunas
técnicas comerciales, entre las que citamos Accu Probe( Gen Probe) la cual con
gran reproducibilidad puede identificar mycobacterias del Complejo M. tuberculosis (sin discriminar especies dentro de este Complejo), M.
avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae. El escaso número de
especies identificadas -aunque
sean las más frecuentes- y la imposibilidad de discriminar dentro del Complejo M. tuberculosis limita en algo el
rendimiento para la identificación.
Otros métodos usados que han probado
ser efectivos son los estudios sobre el gene 16S rRNA y el
gene hsp65 asi como también el gene rpoB. Se trata de métodos de amplificación,
hibridización con sondas y análisis del polimorfismo de los fragmentos de
restricción (RFLP) o secuenciación. Estas técnicas son las que emplean mayor
tecnología y son las más complejas y costosas. Unos pocos tests están
disponibles comercialmente (MicroSeq 500 system) y otro, al parecer algo más
rendidor: el LiPA MYCOBACTERIA test. Aún así
la identificación se limita a pocas especies y no es posible ver
diferencias dentro del Complejo M. tuberculosis.
TAN aplicadas a la sensibilidad del M.
tuberculosis.
En tanto el único mecanismo
reconocido para la adquisición de resistencia en las mycobacterias es la
mutación, si se conoce el gene responsable que se altera, es posible determinar
si hay mutación para la resistencia o no.
Es por eso que las TAN pueden dar resultado excelentes en horas y su
utilidad asistencial puede llegar a ser importantísima. Varias condiciones
deben darse para confeccionar un antibiograma por las TAN: en primer término se
debe identificar el gene responsable, en segundo identificar que tipo de
alteración del DNA genómico se produce (pérdida, sustitución, etc) y por último
si la sensibilidad/resistencia está controlada por uno más genes. Para la
Rifampicina está claro que la resistencia está radicada en la alteración del
gene rpoB y es único, en consecuencia ya se usan TAN con éxito. Más complicado se torna el estudio de
la resistencia a la Isoniacida; codifican la resistencia por lo menos 4 genes
(en el 80% de los casos el katG) por lo que los resultados pueden ser
dudosos. Deben perfeccionarse las TAN para otros fármacos.
TAN aplicadas a la epidemiología de las
mycobacterias.
Desde hace varios años existen diferentes técnicas para establecer parentesco genético o
identidad en las mycobacterias mediante la realización del fingerprinting. La técnica más ampliamente difundida es la RFLP. Consiste
en analizar fragmentos del DNA obtenidos por la acción de enzimas de
restricción, los cuales son exclusivos del Complejo M. tuberculosis –fragmento IS6110-; aquellas porciones de DNA que
poseen el IS6110 son marcadas por una sonda que se fija selectivamente y que
luego de una electroforesis en gel de agarosa
se revelan en bandas de diferente
número, posición y grosor. Típicamente se observan de 5 a 20 copias dando diferentes patrones los cuales
pueden ser comparados en ordenadores. Esta técnica universalmente utilizada es
muy compleja y costosa, pero permite
realizar estudios globales sobre
tipos de cepas circulantes en la comunidad, incorporación de nuevas cepas y
migración de las mismas dentro del territorio. Sin embargo su complejidad no la hace práctica para
situaciones puntuales como: detectar contaminaciones cruzadas dentro del
laboratorio, brotes epidémicos, similitud de cepas multirresistentes, recaída o
reinfección exógena, etc. Para estas
situaciones se dispone de procedimientos alternativos más simples y rápidos;
uno de los más recomendados y del cual hay experiencia en Uruguay es la DRE-PCR
(8). Esta técnica consiste en cortar y luego amplificar por reacción en cadena de la polimerasa
fragmentos que incluyen la doble repetición de porciones del DNA específicas.
Los fragmentos son separados por electroforesis
en gel de agarosa y revelados con bromuro de etidio. Mediante esta técnica es
posible obtener de 4 a 7 bandas siendo suficientes en la mayoría de los casos
para poder afirmar la identidad entre
cepas.
Serología
Casi permanentemente aparecen en el
mercado tests serológicos para la investigación de anticuerpos
antituberculosos, como forma de efectuar un diagnóstico rápido. En términos
generales ninguno posee los atributos de S y Sp mínimos aceptables para ser
usado en la clínica, por lo cual no deben ser tenidos en cuenta.
Dosificación de la Adenosin De Aminasa (ADA).
La ADA es una enzima de origen
fundamentalmente linfocitaria que se halla aumentada en los líquidos serosos de
etiología tuberculosa. Esencialmente, en los líquidos pleurales, donde la
confirmación de la TB es muy dificultosa sea cual sea el procedimiento usado,
la dosificación de ADA (aumentada solamente en la TB) se constituye en un
auxiliar muy valioso para integrar al cuadro general del enfermo. Fácil de
realizar y de bajo costo, ha sido suficientemente probada como para ser adoptada en todos aquellos
laboratorios que procesen una cantidad aceptable de muestras de líquidos de
serosas.
Resumen
La bacteriología de la Tuberculosis
es la piedra angular de todo el control de la enfermedad. Un Laboratorio de
mycobacterias debe contar con los mejores y más rápidos procedimientos para el
diagnóstico, la identificación, las pruebas de sensibilidad a fármacos y debe
tener la capacidad de efectuar
estudios de monitoreo y
vigilancia epidemiológica. Por más moderno
que sea este laboratorio, debe mantener la excelencia en la microscopía (de la
cual no se puede prescindir) y el resto de las técnicas convencionales. Pero
debe acompañar los avances tecnológicos
e ir incorporando las nuevas técnicas que complementen a las
tradicionales para aprovechar su rapidez tan necesaria en ciertos casos
puntuales y su posibilidad de dar respuesta a problemas que de otra manera
quedan sin resolver.
Tabla 1. Porcentajes de confirmación bacteriológica por microscopía
directa en el período 1974 -
2001. Fuente: CHLA – EP.
AÑOS |
TOTAL DE CASOS DE TBC PULMONAR |
TOTAL DE CASOS TBC
PULMONAR CONFIRMADA AL
DIRECTO |
% |
|
|
|
|
|
|
|
|
1974 |
1611 |
855 |
53.07 |
|
|
1975 |
1402 |
753 |
53.71 |
|
|
1976 |
1350 |
748 |
55.41 |
|
|
1977 |
1401 |
855 |
61.03 |
|
|
1978 |
1426 |
864 |
60.59 |
|
|
1979 |
1505 |
952 |
63.26 |
|
|
1980 |
1573 |
1033 |
65.67 |
|
|
1981 |
1458 |
938 |
64.33 |
|
|
1982 |
1239 |
754 |
60.86 |
|
|
1983 |
1144 |
701 |
61.28 |
|
|
1984 |
1191 |
691 |
58.02 |
|
|
1985 |
1046 |
618 |
59.08 |
|
|
1986 |
932 |
600 |
64.38 |
|
|
1987 |
878 |
586 |
66.74 |
|
|
1988 |
796 |
512 |
64.32 |
|
|
1989 |
819 |
555 |
67.77 |
|
|
1990 |
744 |
525 |
70.56 |
|
|
1991 |
642 |
485 |
75.55 |
|
|
1992 |
635 |
451 |
71.02 |
|
|
1993 |
572 |
408 |
71.33 |
|
|
1994 |
536 |
397 |
74.07 |
|
|
1995 |
548 |
346 |
63.10 |
|
|
1996 |
627 |
473 |
75.44 |
|
|
1997 |
606 |
460 |
75.91 |
|
|
1998 |
603 |
414 |
68.66 |
|
|
1999 |
558 |
417 |
74.73 |
|
|
2000 |
555 |
390 |
70.27 |
|
|
2001 |
596 |
367 |
61.58 |
|
Gráfica 1.
Confirmación de la TB Pulmonar por la bacteriología convencional en el Uruguay.
Fuente: Dpto. de Laboratorio. CHLA – EP.
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